Hitung Jumlah Kuman

Ilustrasi : whyislam.org

        HJK (Hitung Jumlah Kuman) adalah pengujian sampel secara bakteriologik secara umum ditujukan untuk mengetahui jumlah bakteri.

Hitung jumlah kuman ada 2 cara :

          Untuk menghitung jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count) yaitu dihitung semua bakteri baik yang hidup maupun yang mati menggunakan cara :

a) Menghitung langsung secara mikroskopik.

        Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil, untuk itu digunakan kaca objek khusus yang bergaris (Petroff-Hauser) berbentuk bujur sangkar. Cara ini hanya dapat digunakan untuk cairan yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi (Lay, 1994).

b) Menghitung berdasarkan kekeruhan

        Dasar teknik ini adalah banyaknya cahaya yang diabsorbsi sebanding dengan banyaknya sel bakteri pada batas-batas tertentu. Pada umumnya untuk menghitung dengan cara ini digunakan turbidimetri (Lay, 1994 ).

          Sedangkan untuk perhitungan hanya Bakteri yang hidup ada 3 cara, yaitu:

a) Standart Plate Count

        Pengenceran dilakukan dengan menggunakan sejumlah botol pengencer yang diisi sampel dan aqua destilata steril. Agar cair didinginkan sampai suhu sekitar 44ºC dan baru kemudian dituangkan ke cawan petri setelah agak membeku cawan dieramkan selama 24-48 jam (37ºC).

b) Plate Count

        Sampel dipipet lalu dimasukkan dalam cawan petri kosong steril, lalu dituang dalam media agar yang mencair, dengan suhu sekitar ± 45ºC lalu digoyangkan dengan hati-hati sehingga sampel dan media tercampur rata. Dibiarkan memadat.

c) Agar sebar

        Sebanyak 0,1 ml sampel dimasukkan pada permukaan agar yang sudah memadat dalam cawan petri. Kemudian sampel diratakan di atas permukaan media tersebut dengan bantuan alat perata atau spreader (Lay, 1994).

Angka Lempeng Total

        ALT (Angka Lempeng Total) adalah metode untuk menetukan jumlah kuman , tidak membedakan spesiesnya dan bersifat semi kuntiatif.  Gabungan dari Metode Pengenceran dan Hitung Cawan.

 Tujuan Pemeriksaan ALT

•      Untuk mengetahui jumlah koloni kuman dalam sampel

•      Untuk memeriksa kualitas air

•      Untuk mengetahui apakah sampel tercemar oleh feses

Prinsip Kerja  ALT

Menentukan jumlah kuman yang hidup tidak berdasarkan spesiesnya kemudian jumlah koloni dikalikan faktor pengenceran pada kolerasi 30-300 koloni.

Media yang digunakan :

1. Pengenceran berseri

        - Saline

    b.  Hitung cawan

        -PCA/NA

Syarat pengambilan sampel

        1. Botol yg digunakan steril

        2. Pengambilan sampel harus secara aseptik

        3. Sampel yang diambil untuk diperiksa harus mewakili keseluruhannya

       

Batas penundaan pemeriksaan 1-12 jam

Prosedur kerja ALT

Ose Kalibrasi

1. Pengertian

        Ose kalibrasi adalah ose yang bulatannya telah diketahui volumenya. Ose kalibrasi digunakan untuk menyetrik sampel ke dalam agar cawan. Banyaknya koloni yang tumbuh dikali fakor perkalian ose kalibrasi.

1. Prinsip Ose Kalibrasi

        Menghitung jumlah kuman yang hidup berdasarkan dengan     mengalihkan jumlah kuman yang hidup dengan factor pengenceran yang didapat dengan cara ose kalibrasi dalam 1 ml air

c. Prosedur Kerja Ose Kalibrasi

                 

Spread Method(Metode sebar) 

Prinsip : Teknik penanaman didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan agar.

        Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0,1 ml pada cawan dengan diameter +/-9 cm. volume yang tepat untuk disebarkan diatas permukaan agar dan cukup mudah mengering sehingga tidak menggenangi permukaan agar. Secara peluang, sel bakteri dapat terambil dengan acak dan seragam dari tabung.

 Cara kerja

1. Disiapkan PCA dalam cawan petri steril, biarkan membeku
2. kemudian dipipet 0,1 ml sampel yang telah diencerkan, kemudian dimasukkan ke atas permukaan agar PCA.
3. Batang hockey stick dicelupkan ke dalam Alkohol 70 % dan dipijarkan hingga alkohol habis terbakar
4. Setelah dingin, hockey stick tersebut digunakan untuk meratakan sampel diatas media agar dengan cara memutarkan cawan diatas meja.
5. Di inkubasi dengan posisi tutup cawan berada di bagian bawah.
6. Di inkubasi selama 24 jam pada suhu 35 – 37 C.

 Kelemahan Spreading Method (Metode Sebar)

        Jika digunakan volume <0,1, maka kemungkinan kesalahannya adalah sel tidak tersebar merata (tidak tersapu oleh batang L) karena volume pelarut kurang walaupun dengan pengenceran yang tepat. Semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) sangat besar pengaruhnya pada hasil yang diperoleh

        Jika volume sampel >0,1 ml, maka volume yang lebih besar otomatis air di permukaan agar lebih banyak sehingga sulit mengering dan dapat menyebabkan pertumbuhannya memenuhi seluruh permukaan agar karena sel dapat disebarkan oleh air.

        Penggunaan teknik penanaman ini sebaiknya dari jenis sampel yang memiliki densitas sel yang tinggi dan dengan pengenceran tertentu yang sesuai. Lebih baik tidak menganalisa jenis sampel seperti air mineral dalam kemasan dengan teknik ini karena dikhawatirkan jika terdapat pertumbuhan maka pertumbuhan tersebut kemungkinan besar adalah kontaminan. Hal ini disebabkan oleh sedikitnya jumlah sel per satuan volum dalam air mineral tersebut, dan jika dari sekian ratus ml sampel hanya diambil 0,1 ml-nya maka secara nalar peluang untuk terambil sangat kecil.

Pour Plate (Teknik Tuang)

          Prinsip : Teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar.

        Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar (bersifat mikroaerofilik). Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300 koloni/cawan.

Prosedur

1. 1 ml sampel yang telah diencerkan, dipipet ke dalam cawan petri
2. Kemudian ke dalam cawan tersebut dimasukkan agar cair yang telah disiapkan pada suhu kurang lebih 45 C sebanyak 20 – 25 mL
3. Selama penuangan, tutup media tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar
4. Setelah dituang lalu diinkubasi 37 C selama 24 jam dan keesokan harinya dihitung banyaknya koloni.

Kelemahan

        Jika digunakan volume <1ml, maka semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) dapat berpengaruh terhadap hasil yang diperoleh.

        Jika > 2 ml maka semakin besar ukuran sampel maka kekuatan agar semakin berkurang dan lama memadat sehingga dapat mempertinggi resiko kesalahan teknis seperti agar jatuh ke tutup cawan. Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi komposisi media semakin encer) dengan penambahan media yang semakin berkurang jika digunakan ukuran cawan yang sama.

        Selain itu, semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah dengan volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat beresiko tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan petri yang akhirnya mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan yang menempel pada tempat itu dapat tumbuh. Ketiga alasan inilah yang menjadi keterbatasan metode pour plate.

V. Perhitungan Cara Langsung Dengan Mikroskop

•      Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atauHaemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu.

•      Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

        Cara kerja :      

1. Digunakan kotak sedang
2. Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu

3. keringkan dengan tissue.
4. Letakkan cover glass di atas alat hitung.

5. Sampel diberi pewarnaan akan memeperjelas pengamatan. Misal : Methylen Blue.
6. Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas.
7. Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).
8. Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.
9. Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.
10. Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.