Teknik Histologi

Oleh : Heru Susanto,S.Si

Teknik Histologi adalah tahapan2 dalam melakukan teknik sito-histologi dimulai dari mendapatkan jaringan sampai dihasilkan preparat yang siap diperiksa secara mikroskopis

Tahapan Teknik Sito-Histologi

1. Mendapatkan Jaringan
2. Fiksasi
3. Dehidrasi
4. Clearing
5. Embedding
6. Sectioning/Cutting
7. Mounting
8. Staining
9. Labeling

Mendapatkan Jaringan

• Jaringan harus diduga tumor atau kelainan
• Jaringan harus sudah difikasasi sebelum 6 jam setelah kematian, bisa terjadi maserasi
• Pemotongan menggunakan pisau tajam ukuran biasanya (1,5x1x0,5) cm³
• Mendapatkan Jaringan
• Harus segera dimasukkan ke dlm larutan fiksasi (Volume 40x) selama 1 malam

-  Tidak boleh dicuci dg air (terjadi perubahan tekanan osmotik

 - Tidak boleh disimpan dlm NaCl 0,9 % -maserasi

- Tidak boleh dibekukan-pembentukan kristal es dlm sitoplasma

            -Jaringan berbentuk tulang harus didekalsifikasi agar lunak dg HCl 0,5 % 

Fiksasi Jaringan

Fiksasi Jaringan adalah Proses mengawetkan jaringan agar awet dan kondisinya sama seperti hidup. Dilakukan dengan merendam jaringan ke lart fiksasi (volume min 20x besar jar) selama 24  jam

Fiksasi Jaringan

Manfaat Fiksasi :

•Sel & jar keadaannya seperti  hidup

•Membunuh Bakteri

•Mematikan sel secara serentak

•Mengeraskan jaringan

•Melindungi sel dari prosesselanjutnya

•Mempermudah pengecatan

•Melindungi sel/jar dari autolysis dan putrefaction

Fiksasi Jaringan

Berdasar Cara Kerja :

P  Precipitant  fixatives (mengkoagulasikan protein) ex : Mercuri klorida, alkohol

P  Non Precipitant fixatives (mendenaturasikan protein) ex : Potassium diphosphat

Berdasar Tujuan Pemakaian :

P  Micro Anatomical Fixatives (melihat komponen jar scr keseluruhan) ex : susa, Bouin, Zenker

P  Cytological Fixatives :

                melihat komponen  inti, ex : Fleming, Corney, Sanpelice.

                melihat komponen sitoplasma,  ex : Formaldehida (5% Formal saline), Fleming dikurangi asam asetat galsial,

BERDASARKAN KOMPOSISINYA

ü  Simple fixative (Zat fiksatif  yang dipakai tunggal) ex : Mercuri Chlorida, Alkohol, Picric Acid, Chromic Acid

ü  Compound  fixatives (Zat fiksatif yang digunakan secara gabungan) ex : NaCl Formalin, Suza, Zenker, dsb.

Kecepatan penetrasi zat Fiksatif  Berbeda-beda

ü  Paling cepat : asam acetat glacial

ü  Paling lambat : Osmium Tetraoksida (OsO4)

SIFAT ZAT FIKSATIF

    Alkohol                                                 - Mengeraskan jaringan.

                                                               - Daya penetrasi kuat.

                                                               - Melarutkan kromatin

    Asam Asetat Glasial- Melunakan  jaringan.

                                                               - Daya penetrasi kuat.

                                                               - Memfiksasi  kromatin

Dehidrasi
Proses penarikan air secara aktif dari dalam jaringan

Proses Dehidrasi

Untuk memudahkan proses infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan alkohol dari konsentrasi rendah-tinggi

Proses Dehidrasi

}  Contoh Proses Dehidrasi

ü   alkohol 70%.......... 1 hari

ü  alkohol 80%........... 1 hari

ü  alkohol 90%........... 1 hari

ü  alkohol 95% .......... 1 hari

ü  alkohol 95% .......... 1 hari

ü  alkohol 100% ........ 1 hari

ü  alkohol 100% ........ .1 hari

 Alkohol dapat dimurnikan kembalidengan cuprisulfat (CuSO4) Cuprisulfat -putih (tak mengandung air) akan berubah menjadi biru (mengandung air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah disimpan beberapa hari. Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di hilangkan airnya dengan cara memanaskan.

Proses Dehidrasi

Lamanya waktu tergantung pada :

• Besar kecilnya jaringan
• Konsentrasi jaringan
• Macam zat fiksasi yang dipakai
• Sifat clearing agent yang dipakai

Proses Clearing

Syarat clearing agent harus melarutkan alkohol dan parafin

Clearing agent yang biasa dipakai :

• Xylene.
• Benzene
• Toluen
• Chloroform

EMBEDDING

Embedding adalah Proses memasukkan jaringan ke dlm parafin cair untuk dibuat blok yg padat

Meliputi :

q  Impregnation

q  Blocking

q  Trimming

Proses Embedding

Impregnation.

proses penggantian larutan toluen dengan parafin cair

Blocking.

Memasukkan jaringan ke dalam parafin cair - dipadatkan (menurunkan suhu parafin)-dicetak

Trimming.

Meratakan/merapikan jaringan yg telah diblock parafin dengan menggunakan pisau atau langsung dengan mikrotome, sehingga pada saat pemotongan didapatkan potongan bentuk jaringan yang baik

Proses 
SECTIONING / CUTTING

Sectioning adalah proses pemotongan jar dengan mikrotom-ukuran sangat tipis 4-10 µ-tembus cahaya saat diperiksa dg mikroskop

Diperhatikan :

P  Pisau harus tajam

P  Blok jaringan harus dingin

P  Ketebalan pemotongan harus disesuaikan dengan jenis jaringan

Proses Sectioning

Dinginkan pada lemari es / cold plate - akan terlepas dari cetakan bloknya dan tempatkan pada hold mikrotome untuk dipotong  (ketebalan 3 – 5 µ) -membentuk lembaran pita

MOUNTING

Menempelkan potongan jaringan yg baik ke obyek glass

Proses Mounting

}  Obyek glass diberi albumin agar Jar menempel dg baik

}  Dimasukkan ke dalam water bath suhu 30 ⁰C - lembaran pita tidak melipat

}  Bila sudah menempel dikeringkan/ diriskan (Bisa dg Hot Plate)

}  Stretching tissue in warm water.

Staining
 mewarnai preparat

Staining

Macam pewarnaan berdasarkan asal zat warna :

Natural Dyes,

Acid Carmine : ekstrak serangga betina yang hidup di pohon kaktus di daerah tropis.

Hematoxyline : getah pohon Haematoxylinecampechianum

Syntetic Dyes

Benzene, Quinone, Anilline.

Staining

Prinsip Kerja Pewarnaan :

ü  Secara umum zat warna yang bersifat asam akan mewarnai bagian sel yang bersifat basa dan sebaliknya

ü  cat netral (gugus asam dan gugus basa keduanya berwarna) Misal :

ü  Romanowsky ,(Camp methylen Blue & Eosin)

Staining

Berdasarkan waktu :

• Direct Staining, molekul zat warna langsung ditangkap oleh jaringan, misalnya Eosin
• Indirect Staining, molekul zat warna baru bisa ditangkap oleh jaringan jika menggunakan zat perantara yang disebut Mordant, misalnya Haematoxyline menggunakan Potasium Alum sebagai mordantnya.

Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)

Menggunakan 2 macam zat warna yaitu

q  Hematoksilin -memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik)

q  Eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda. 

Interpretasi hasil :

P  Inti sel bewarna   biru

P  Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu